Test genetici preimpianto nei cicli di fecondazione in vitro

Il test genetico preimpianto è un metodo di analisi degli embrioni di nuova generazione che offre sia un'alternativa ai metodi di analisi genetica prenatale quali il prelievo dei villi coriali (CVS) e l'amniocentesi per le coppie che hanno un rischio elevato di trasmettere una malattia genetica alla prole, sia una piattaforma di analisi per i pazienti con fallimenti ricorrenti della fecondazione in vitro e aborti spontanei ricorrenti.

Mentre i metodi di test genetici prenatali possono essere impiegati solo in un certo momento durante la gravidanza, la PGT offre test genetici sugli embrioni prima della gravidanza, eliminando quindi la probabilità di essere incinta di una prole con problemi genetici. Le origini della PGD/PGS risalgono al 1968, quando Edwards e Gardner eseguirono la prima biopsia embrionale microchirurgica su embrioni di coniglio colorando la cromatina sessuale della blastocisti di coniglio con euchrysine 2GNX. Tuttavia, solo all'inizio degli anni '90 fu eseguito il primo caso di PGT per esaminare il sesso dell'embrione per un disturbo autosomico recessivo legato al sesso.

Il test genetico preimpianto (PGT) è un progresso fondamentale nella tecnologia di riproduzione assistita (ART), in particolare nella fecondazione in vitro (IVF). Il PGT prevede l'analisi genetica degli embrioni prima del trasferimento uterino, con l'obiettivo di migliorare i tassi di impianto, ridurre i rischi di aborto spontaneo e prevenire la trasmissione di disturbi genetici. La tecnologia si è evoluta in modo significativo negli ultimi decenni ed è classificata in tre tipi principali: PGT-A (per lo screening delle aneuploidie), PGT-M (per disturbi monogenici o monogenici), e PGT-SR (per riarrangiamenti strutturali). Di seguito, troverete informazioni sui diversi tipi di PGT, gli scenari clinici per cui sono adatti e la loro efficacia complessiva.

Tipi di test genetici preimpianto

1. PGT-A (Test genetico preimpianto per aneuploidia)
PGT-A esamina gli embrioni per anomalie cromosomiche numeriche (aneuploidie). Le aneuploidie sono una delle principali cause di fallimento dell'impianto, aborto spontaneo e disturbi cromosomici come la sindrome di Down (trisomia 21), la sindrome di Patau (trisomia 13) e la sindrome di Edwards (trisomia 18).

Indicazioni:
Età materna avanzata (>35 anni), in cui i tassi di aneuploidia aumentano a causa di errori di segregazione cromosomica correlati all'età.
Fallimenti ricorrenti dell'impianto o ripetuti fallimenti della fecondazione in vitro.
Aborto ricorrente (RPL), spesso associato ad anomalie cromosomiche negli embrioni.
Infertilità dovuta al fattore maschile, poiché il rischio di aneuploidia può aumentare in caso di determinate anomalie dello sperma.
Selezione del genere per scopi di bilanciamento familiare

Procedura:
Gli embrioni vengono sottoposti a biopsia (solitamente allo stadio di blastocisti) per estrarre alcune cellule del trofectoderma, che vengono poi analizzate utilizzando tecniche come FISH o sequenziamento di nuova generazione (NGS), a seconda dello scopo del trattamento. Nei casi in cui la selezione del genere è l'obiettivo primario senza precedenti di malattie genetiche, una semplice analisi FISH può fornire un pannello di base di 5 cromosomi che testa i disturbi genetici più comuni sui cromosomi 13, 18 e 21, nonché X e Y.

Successo e limiti:
È stato dimostrato che la PGT-A migliora i tassi di natalità in alcune popolazioni, come le donne anziane e quelle con precedenti cicli falliti, ma la sua applicazione universale rimane controversa. Alcuni studi suggeriscono che non vi siano benefici significativi nei pazienti più giovani con buona prognosi (Munné et al., 2019). Inoltre, il mosaicismo, in cui alcune cellule nell'embrione sono normali e altre sono aneuploidi, può complicare l'interpretazione e i risultati. In molti casi, gli embrioni che sono stati considerati mosaici possono continuare a eliminare il mosaicismo e svilupparsi in embrioni geneticamente sani ed euploidi. Quando la PGT-A viene eseguita in popolazioni giovani e sane, ciò può causare lo scarto di embrioni che possono potenzialmente svilupparsi in esseri umani geneticamente sani. Nel complesso, questa è un'opzione adatta per i pazienti che optano per la selezione del genere per scopi di bilanciamento familiare, pazienti con ripetuti fallimenti di fecondazione in vitro o aborti spontanei ricorrenti.

2. PGT-M (Test genetico preimpianto per malattie monogeniche)
PGT-M identifica gli embrioni portatori di disturbi monogenici (ad esempio, fibrosi cistica, anemia falciforme, malattia di Huntington). Le coppie portatrici di una mutazione genetica nota o con una storia familiare di una specifica condizione genetica traggono beneficio da questo test.

Indicazioni:
– Screening dei portatori per condizioni autosomiche recessive o dominanti.
– Prevenzione delle malattie legate al cromosoma X (ad esempio, distrofia muscolare di Duchenne, emofilia).
– Coppie con una variante patogena nota in uno o entrambi i partner.

Procedura:
Ciò comporta test personalizzati utilizzando tecniche come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o NGS per rilevare la mutazione specifica. Spesso, l'analisi di linkage viene eseguita insieme al rilevamento della mutazione per confermare i risultati e ridurre il rischio di diagnosi errata. Ciò significa che la coppia che desidera sottoporsi al test con PGT-M dovrà sottoporsi a un test genetico dettagliato che mostri le mutazioni genetiche specifiche in modo che una sonda di test specifica possa essere progettata per un processo di test personalizzato. Ai pazienti che non hanno un rapporto dettagliato sui test genetici viene solitamente chiesto di venire a Cipro due volte: una volta per lasciare un campione di sangue affinché venga eseguito un test di mutazione approfondito, dopodiché una sonda di test può essere personalizzata e una seconda volta per il processo di fecondazione in vitro.

Successo e limiti:
PGT-M fornisce una precisione di circa 98-99% nella prevenzione della trasmissione di condizioni genetiche quando eseguito in laboratori accreditati (Kuliev et al., 2020). Tuttavia, le sfide includono la necessità di un'analisi genetica dettagliata della coppia e la possibilità di embrioni insufficienti per il test. Le donne in fasce di età più avanzate con riserve ovariche ridotte possono talvolta trarre vantaggio da più cicli di raccolta di ovociti al fine di massimizzare il numero di embrioni che verranno ottenuti. In tali casi, verrà programmato un prelievo di ovociti durante entrambi i viaggi.

3. PGT-SR (Test genetico preimpianto per riarrangiamenti strutturali)
PGT-SR è finalizzato a rilevare anomalie strutturali cromosomiche, come traslocazioni, inversioni o duplicazioni. Tali riarrangiamenti possono portare a embrioni sbilanciati, causando aborto spontaneo o anomalie congenite. Le pazienti con traslocazioni bilanciate spesso non mostrano alcun sintomo. Tuttavia, quando cercano di avere una gravidanza, alcuni degli embrioni risultanti presentano aberrazioni cromosomiche mortali, che causano gravidanze fallite o aborti spontanei ricorrenti. Le persone con riarrangiamenti cromosomici bilanciati, come le traslocazioni robertsoniane o reciproche, spesso si sottopongono a PGT-SR per garantire la selezione di embrioni bilanciati che non porteranno ad aborto spontaneo o disturbi dello sviluppo (Munné et al., 2020).

Indicazioni:
Portatori di traslocazioni cromosomiche bilanciate (ad esempio, robertsoniana o reciproca)
Coppie con una storia di aborti spontanei ricorrenti o figli con anomalie cromosomiche strutturali.

Procedura:
Il PGT-SR impiega metodi come l'NGS per rilevare anomalie strutturali, utilizzando essenzialmente una procedura di test simile al PGT-A.

Successo e limiti:
PGT-SR riduce significativamente il rischio di aborto spontaneo nelle portatrici di traslocazione, con studi che riportano tassi di gravidanza clinica di 50-70% rispetto a tassi inferiori nei cicli non trattati (Collins et al., 2021). Tuttavia, questo approccio potrebbe non eliminare completamente il rischio di esiti anomali, poiché il test valuta solo la struttura cromosomica e non la funzione genica. Se ci sono ulteriori problemi genetici, questo test non li affronterà. Tuttavia, ciò avrebbe un'incidenza molto bassa.

Efficacia e impatto clinico della PGT

Tassi di impianto e tassi di natalità viva
PGT, in particolare PGT-A, ha mostrato risultati promettenti nel migliorare i tassi di impianto e i tassi di natalità in popolazioni specifiche, come le donne con più di 35 anni o quelle con fallimento ricorrente dell'impianto. Per PGT-M e PGT-SR, la misura di successo primaria è la prevenzione di condizioni genetiche o cromosomiche nella prole, con alti tassi di accuratezza segnalati in numerosi studi (Practice Committee of the ASRM, 2020).

Riduzione dei tassi di aborto spontaneo
La PGT-A è stata associata a tassi di aborto spontaneo inferiori, specialmente in pazienti con aborti ricorrenti. Il rilevamento e l'esclusione di embrioni aneuploidi riducono significativamente l'aborto in questi casi. Le coppie con una storia di aborti spontanei ricorrenti, specialmente a causa di anomalie cromosomiche, traggono beneficio dalla PGT per migliorare la probabilità di una gravidanza di successo selezionando embrioni cromosomicamente normali (Carp, 2018).

Infertilità maschile:I casi gravi di infertilità maschile possono aumentare il rischio di anomalie cromosomiche negli embrioni, rendendo il PGT-A consigliabile in tali casi per ridurre tale rischio (Kushnir et al., 2016).

Procedura del test genetico preimpianto

La PGT può essere offerta solo come parte di un ciclo di fecondazione in vitro (FIV) perché è l'unico modo in cui gli embrioni possono essere creati in un ambiente di laboratorio per essere sottoposti a procedure di biopsia e test. Il processo PGT prevede diversi passaggi chiave all'interno di un ciclo di fecondazione in vitro:

1. Stimolazione ovarica e prelievo degli ovociti: Innanzitutto, la donna viene sottoposta a stimolazione ovarica con farmaci ormonali per produrre più ovuli. Questi ovuli vengono poi recuperati dalle ovaie tramite una piccola procedura chirurgica chiamata "prelievo degli ovociti" (Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, 2018). Le donne con una funzione ovarica fortemente ridotta potrebbero dover sottoporsi a più prelievi di ovuli per ottenere un numero sufficiente di embrioni da testare. Tieni presente che più alto è il numero di embrioni, più alta è la probabilità di ottenere embrioni vitali per il trasferimento.

2. Fecondazione e coltura embrionale: Gli ovuli recuperati vengono fecondati in laboratorio con lo sperma, in genere utilizzando l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) per garantire che un solo spermatozoo entri in ogni ovulo. Questo processo riduce al minimo il rischio di contaminazione da parte di ulteriori spermatozoi, che potrebbero altrimenti influenzare i risultati dei test genetici (Scott et al., 2013).

3. Biopsia dell'embrione: Al quinto giorno dopo la fecondazione, gli embrioni raggiungono lo stadio di blastocisti. A questo punto, alcune cellule vengono rimosse con attenzione dallo strato esterno dell'embrione (trofectoderma) per i test genetici. Questa procedura di biopsia non sembra danneggiare lo sviluppo dell'embrione o il potenziale di impianto poiché vengono estratte solo poche cellule (Benoff et al., 1999).

4. Analisi genetica: Le cellule biopsiate vengono sottoposte ad analisi genetica utilizzando tecniche come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) o la reazione a catena della polimerasi (PCR). L'NGS è diventato il metodo preferito per PGT-A grazie alla sua elevata accuratezza nel rilevamento di anomalie cromosomiche (Franasiak et al., 2014).

5. Trasferimento di embrioni: Una volta che i risultati del test genetico sono disponibili, gli embrioni identificati come esenti dalle anomalie genetiche mirate o dai problemi cromosomici vengono selezionati per il trasferimento nell'utero della donna. Il test spesso richiede alcuni giorni. Ciò significa che gli embrioni di solito non vengono trasferiti nello stesso ciclo della procedura di fecondazione in vitro. Normalmente, il giorno 5 della fase di formazione della blastocisti è quando avviene il trasferimento dell'embrione (circa il giorno 20 del ciclo mestruale della donna). Quando il test genetico richiede alcuni giorni, questa finestra di trasferimento dell'embrione viene persa, il che significa che la paziente dovrà essere preparata per un trasferimento dell'embrione nel ciclo mestruale successivo. Ciò viene fatto congelando gli embrioni dopo il processo di biopsia.

Il test genetico preimpianto è uno strumento trasformativo nella medicina riproduttiva, che consente risultati migliori nei cicli di fecondazione in vitro e la prevenzione delle malattie genetiche. Ogni tipo di PGT, PGT-A, PGT-M e PGT-SR, ha indicazioni e benefici distinti, rendendo essenziale adattarne l'uso alle circostanze individuali dei pazienti.

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Riferimenti

Benoff, S., Hurley, IR, Cooper, GW, Mandel, FS, Rosenfeld, DL, & Hershlag, A. (1999). Le inseminazioni con fecondazione in vitro a dose compensata numerica producono alti tassi di fecondazione e gravidanza. Fertility and Sterility, 71(6), 1067–1072. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(99)00311-8.

Carp, H. (2018). "Perdita ricorrente della gravidanza: cause, controversie e trattamento". Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology, 53, 3-12. doi:10.1016/j.bpobgyn.2018.08.005.

Collins, SC, Zegers-Hochschild, F., & Cobo, A. (2021). Test genetici preimpianto per riarrangiamenti strutturali: percentuali di successo e sfide. Fertility and Sterility, 115(5), 1201–1210.

Fragouli, E., Alfarawati, S., Spath, K., & Wells, D. (2017). "L'origine e l'impatto dell'aneuploidia embrionale nella pratica della fecondazione in vitro umana". Cytogenetic and Genome Research, 150(3-4), 217-227. doi:10.1159/000478888.

Franasiak, JM, et al. (2014). “Sequenziamento di nuova generazione per lo screening genetico preimpianto dell'aneuploidia come alternativa all'ibridazione genomica comparativa array”. Molecular Cytogenetics, 7, 19. doi:10.1186/1755-8166-7-19.

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Geraedts, J., & Sermon, K. (2016). “Test genetici preimpianto: sviluppi recenti e prospettive future”. Human Reproduction Update, 22(4), 402-405. doi:10.1093/humupd/dmw007.

Greco, E., et al. (2015). “Doppia scissione dello zigote: un nuovo indicatore dello sviluppo dell'embrione.” Fertilità e sterilità, 103(6), 1290-1296. doi:10.1016/j.fertnstert.2015.02.025.

Kuliev, A., Rechitsky, S., & Tur-Kaspa, I. (2020). Test genetici preimpianto per disturbi monogenici: venticinque anni di esperienza. Reproductive Biomedicine Online, 41(3), 379–390.

Kushnir, VA, Solouki, S., Darmon, SK, Barad, DH, & Gleicher, N. (2016). Infiammazione sistemica e autoimmunità nelle donne con endometrite cronica. American Journal of Reproductive Immunology, 75(6), 672–677. https://doi.org/10.1111/aji.12508

Munné, S., Spinella, F., & Grifo, JA (2019). Risultati clinici dopo l'applicazione di PGT-A nei cicli di fecondazione in vitro: una revisione. Human Reproduction Update, 25(2), 209–222.

Comitato di pratica dell'American Society for Reproductive Medicine (ASRM). (2020). Applicazioni cliniche dei test genetici preimpianto: un parere del comitato. Fertilità e sterilità, 113(2), 305–322.

Scott, RT, Jr, Upham, KM, Forman, EJ, Zhao, T., & Treff, NR (2013). La biopsia in fase di scissione compromette significativamente il potenziale di impianto embrionale umano mentre la biopsia della blastocisti non lo fa: uno studio clinico randomizzato e in coppia. Fertility and Sterility, 100(3), 624–630. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.04.039