Trasferimento citoplasmatico

Trattamento di fecondazione in vitro con trasferimento citoplasmatico

Il trasferimento citoplasmatico è una tecnica sviluppata per migliorare la competenza ovocitaria integrando un ovulo con componenti citoplasmatici di un ovulo donato, con l'obiettivo di migliorare la capacità metabolica e di sviluppo dell'ovocita ricevente. La logica si basa sul fatto che la qualità ovocitaria è determinata non solo dal DNA nucleare, ma anche dall'ambiente citoplasmatico, che contiene mitocondri, mRNA, proteine e fattori regolatori che controllano lo sviluppo embrionale precoce prima che il genoma embrionale venga attivato. Negli ovociti invecchiati e negli ovociti di donne con ripetuti fallimenti di fecondazione in vitro, questo meccanismo citoplasmatico è spesso compromesso, anche quando i cromosomi appaiono normali (May-Panloup et al., 2016; Fragouli e Wells, 2015).

I mitocondri sono particolarmente importanti in questo contesto. Gli ovociti contengono centinaia di migliaia di mitocondri, molti di più di qualsiasi altro tipo di cellula, poiché la fecondazione e la segmentazione embrionale precoce richiedono una produzione di energia estremamente elevata. Con l'invecchiamento delle donne, il DNA mitocondriale accumula mutazioni, la produzione di ATP diminuisce e le specie reattive dell'ossigeno aumentano, portando a una formazione alterata del fuso, errori di segregazione cromosomica e uno sviluppo embrionale inadeguato (Bentov e Casper, 2013; May-Panloup et al., 2016). Il trasferimento citoplasmatico mira a ripristinare parzialmente questo ambiente metabolico introducendo mitocondri sani e fattori citoplasmatici associati da un giovane ovocita donatore nell'ovulo della paziente al momento dell'ICSI.

A differenza della terapia sostitutiva mitocondriale (MRT), il trasferimento citoplasmatico non rimuove l'intera struttura citoplasmatica del paziente, inclusi i mitocondri, né la sostituisce interamente. Invece, una frazione del citoplasma dell'ovulo del paziente viene aspirata (svuotata) e un volume corrispondente di citoplasma del donatore, solitamente 10-15 TP3T dell'intero citoplasma, viene iniettato insieme allo spermatozoo. Ciò significa che l'embrione risultante contiene una miscela di mitocondri, principalmente del paziente e in piccola parte del donatore. L'obiettivo non è quello di creare un "embrione a tre genitori" in senso genetico, ma di migliorare la bioenergetica cellulare in modo che il DNA nucleare del paziente possa essere espresso correttamente durante le prime fasi dello sviluppo (Barritt et al., 2001; Zhang et al., 2017).

Perché viene utilizzata una frazione così piccola di citoplasma di una donatrice di ovuli?

Il trasferimento citoplasmatico è deliberatamente limitato a una piccola frazione del citoplasma del donatore perché l'obiettivo è supportare l'ovocita della paziente, non sostituirlo.

L'ovulo non è solo un contenitore di DNA. Il suo citoplasma contiene una rete altamente organizzata e spazialmente strutturata di mitocondri, mRNA, ribosomi, riserve di calcio, proteine di ancoraggio del fuso e segnali di polarità che si sono accumulati nel corso di molti mesi di maturazione dell'ovocita. Queste strutture determinano dove si forma il fuso, come vengono orientate le prime divisioni mitotiche e come si stabiliscono gli assi embrionali. Se si sostituisce troppo citoplasma, si rischia di alterare questa organizzazione. Una sostituzione citoplasmatica di grandi volumi può alterare le oscillazioni del calcio al momento della fecondazione, il posizionamento del fuso e la geometria di segmentazione precoce, tutti fattori estremamente sensibili all'architettura citoplasmatica (May-Panloup et al., 2016; Schatten & Sun, 2011). È qui che il trasferimento citoplasmatico può effettivamente essere più vantaggioso rispetto alla sostituzione completa nella MRT, a meno che l'età del paziente non sia superiore ai 40 anni e le sue strutture citoplasmatiche non siano considerate ottimali.

A livello mitocondriale, la finestra 10–15% viene scelta per ottenere un recupero metabolico senza acquisizione genetica. Un ovocita umano contiene circa 100.000–300.000 mitocondri. Gli ovociti invecchiati o danneggiati possono avere mitocondri che producono meno ATP e più specie reattive dell'ossigeno, il che compromette l'integrità del fuso e lo sviluppo dell'embrione. L'introduzione di citoplasma donatore sano 10–15% fornisce decine di migliaia di mitocondri funzionali, sufficienti per aumentare notevolmente la produzione di ATP e ridurre lo stress ossidativo nel citoplasma (Bentov & Casper, 2013; Fragouli & Wells, 2015).

Tuttavia, se si introduce troppo citoplasma del donatore, si crea un'elevata eteroplasmia mitocondriale. Ciò significa che due popolazioni mitocondriali concorrenti sono presenti a livelli simili. Nei modelli animali e negli studi sulle cellule umane, un'elevata eteroplasmia può portare alla segregazione mitocondriale durante le prime divisioni cellulari, a una distribuzione imprevedibile dei tessuti e, in alcuni casi, alla perdita di efficienza metabolica nel tempo, poiché popolazioni mitocondriali incompatibili competono (Wallace & Chalkia, 2013; Stewart & Chinnery, 2015). Mantenendo i mitocondri del donatore nell'intervallo 10–15%, la maggior parte degli embrioni torna naturalmente a dominare i mitocondri del paziente nelle divisioni successive, beneficiando comunque della spinta metabolica precoce durante le fasi critiche di segmentazione e blastocisti.

Ecco perché il trasferimento citoplasmatico è fondamentalmente diverso dalla terapia sostitutiva mitocondriale. La MRT rimuove deliberatamente quasi tutti i mitocondri del paziente e li sostituisce con mitocondri del donatore in un nuovo ambiente citoplasmatico per prevenire la malattia mitocondriale. Il trasferimento citoplasmatico fa l'opposto: preserva l'identità citoplasmatica del paziente e la compatibilità nucleare-citoplasmatica, fornendo all'ovulo un apparato sano sufficiente per superare le prime fasi dello sviluppo. Entrambi i metodi presentano vantaggi per diversi gruppi di pazienti.

Cosa può e cosa non può fare il trasferimento citoplasmatico

Ciò che il trasferimento citoplasmatico può fare è migliorare i tassi di fecondazione, le dinamiche di segmentazione e la formazione di blastocisti in pazienti selezionate i cui ovociti falliscono nonostante spermatozoi normali e una ragionevole risposta ovarica. Nei primi studi clinici, il trasferimento citoplasmatico è stato associato a tassi di sviluppo embrionale e nascite vive più elevati in donne con ripetuti fallimenti della fecondazione in vitro (Barritt et al., 2001). Studi più recenti hanno dimostrato che il miglioramento della funzione mitocondriale negli ovociti invecchiati o compromessi può migliorare direttamente la stabilità del fuso, la produzione di ATP e la competenza embrionale (Bentov e Casper, 2013; Fragouli e Wells, 2015). Ciò rende il trasferimento citoplasmatico particolarmente rilevante per le donne con disfunzione ovocitaria correlata all'età, scarso sviluppo embrionale nonostante embrioni cromosomicamente normali o ripetuti fallimenti di impianto.

Tuttavia, è altrettanto importante chiarire cosa il trasferimento citoplasmatico non può fare. Non corregge le anomalie cromosomiche nell'ovulo. Se un ovocita presenta una non disgiunzione o un grave danno al DNA, l'aggiunta di citoplasma sano non risolverà il problema. Inoltre, non elimina le malattie mitocondriali ereditarie, poiché i mitocondri del paziente rimangono dominanti nell'embrione. Per questo motivo, il trasferimento citoplasmatico non viene utilizzato per prevenire la trasmissione di malattie genetiche mitocondriali; questo è il ruolo della MRT, in cui il DNA nucleare viene trasferito in un ovocita donatore che contiene solo mitocondri sani (Craven et al., 2010; Hyslop et al., 2016).

In termini pratici, il trasferimento citoplasmatico è meglio considerato una strategia di salvataggio metabolico per gli ovociti che presentano DNA nucleare intatto ma meccanismi cellulari compromessi. Può migliorare lo sviluppo embrionale e il potenziale di impianto in alcuni gruppi di pazienti, ma non prevale sulla genetica, non ringiovanisce i cromosomi e non sostituisce gli ovociti di una donatrice in caso di grave aneuploidia o insufficienza ovarica. Se utilizzato correttamente, si colloca tra la fecondazione in vitro standard e la terapia sostitutiva mitocondriale completa, offrendo un modo biologicamente razionale per migliorare la competenza ovocitaria senza sostituire l'identità genetica della paziente.

Come funziona il trattamento di fecondazione in vitro citoplasmatica nella pratica clinica?

Nei moderni programmi di trasferimento citoplasmatico, la procedura non è progettata attorno a un singolo ovulo. È progettata attorno a probabilità, ridondanza e selezione, poiché anche quando la funzione citoplasmatica è migliorata, la genetica nucleare sottostante dell'ovocita segue ancora la biologia correlata all'età. Per questo motivo, miriamo a lavorare con un minimo di circa cinque ovociti maturi (M2) come soglia pratica per risultati significativi. Questo non è arbitrario. I tassi di fecondazione, i tassi di formazione di blastocisti e i tassi di euploidia operano tutti come probabilità moltiplicative. Quando sono disponibili solo uno o due ovociti, anche un trasferimento citoplasmatico biologicamente riuscito ha un'alta probabilità di non produrre embrioni trasferibili semplicemente a causa dell'attrito statistico (Fragouli & Wells, 2015; Franasiak et al., 2014).

Poiché molte pazienti candidate al trasferimento citoplasmatico sono scarsamente responsive o in età riproduttiva avanzata, raggiungere cinque ovociti M2 in un singolo ciclo potrebbe non essere possibile. In questi casi, l'accumulo di ovociti in più prelievi diventa una parte essenziale della strategia. Ogni prelievo si aggiunge al pool di ovociti M2 che possono essere fecondati e ricevere l'integrazione citoplasmatica. Questo concetto è ben consolidato nella fecondazione in vitro con bassa riserva e nella preservazione della fertilità, dove il numero cumulativo di ovociti, piuttosto che la resa di un singolo ciclo, è il più forte predittore di successo (Cobo et al., 2016; Vaiarelli et al., 2020). Nel contesto del trasferimento citoplasmatico, l'accumulo è ancora più importante perché la tecnica viene applicata a ovociti già biologicamente svantaggiati.

Il motivo per cui la soglia dei cinque ovociti è importante non è solo la fecondazione, ma anche lo sviluppo embrionale e la selezione genetica. Anche nei cicli di fecondazione in vitro ottimizzati, solo una frazione degli ovociti fecondati raggiungerà lo stadio di blastocisti e solo una frazione di blastocisti sarà cromosomicamente normale. Ampi set di dati PGT-A mostrano che nelle donne quarantenni, solo 10-30% di blastocisti sono euploidi, anche quando lo sviluppo embrionale è buono (Franasiak et al., 2014; Tiegs et al., 2020). Il trasferimento citoplasmatico può migliorare la competenza dello sviluppo, il che significa che più embrioni raggiungono lo stadio di blastocisti, ma non modifica il tasso di errore meiotico che causa l'aneuploidia. Ciò significa che sono ancora necessari numeri per ottenere un embrione sano.

Ecco perché il trasferimento citoplasmatico è più potente quando è incorporato in una strategia che mira a produrre embrioni multipli, seguito da Test PGT-A per identificare quali di questi embrioni siano veramente cromosomicamente normali. L'integrazione citoplasmatica aiuta gli embrioni a sopravvivere allo stress metabolico dello sviluppo precoce e a raggiungere lo stadio di blastocisti, ma è la PGT-A a consentire di selezionare l'embrione che presenta sia una funzione citoplasmatica migliorata sia una genetica nucleare intatta. Senza questa fase di selezione finale, il beneficio del trasferimento citoplasmatico è diluito dall'elevato tasso di aneuploidia di fondo, in particolare nei pazienti più anziani (Fragouli & Wells, 2015; Tiegs et al., 2020).

Da un punto di vista probabilistico, questo significa che più embrioni si possono creare, maggiori sono le probabilità di successo. Ogni ovocita M2 ha una certa probabilità di essere fecondato, ogni uovo fecondato ha una certa probabilità di diventare una blastocisti e ogni blastocisti ha una certa probabilità di essere euploide. Il trasferimento citoplasmatico accelera la fase intermedia, la formazione della blastocisti, ma non rimuove il collo di bottiglia finale, ovvero la normalità cromosomica. Accumulare ovociti fino a raggiungere almeno cinque M2, creare diversi embrioni e quindi utilizzare la PGT-A per selezionare il migliore è quindi il modo in cui il trasferimento citoplasmatico si trasforma da una tecnica biologicamente interessante in un trattamento clinicamente significativo (Franasiak et al., 2014; Vaiarelli et al., 2020).

In termini pratici, ciò significa che alcune pazienti avranno bisogno di due, tre o anche più prelievi di ovociti prima di eseguire la PGT-A e il trasferimento embrionale, in modo che siano disponibili embrioni sufficienti a giustificare la procedura. L'obiettivo non è ottenere un embrione in tempi rapidi, ma generare una coorte di embrioni da cui selezionare un embrione geneticamente sano e con capacità di sviluppo, offrendo alla paziente una reale possibilità di gravidanza piuttosto che un singolo tentativo con scarse probabilità di successo.