Цитоплазматический перенос

ЭКО с переносом цитоплазмы.

Цитоплазматический перенос — это методика, разработанная для повышения компетентности ооцитов путем добавления в яйцеклетку цитоплазматических компонентов из донорской яйцеклетки с целью улучшения метаболических и эволюционных возможностей ооцита-реципиента. Обоснование основано на том факте, что качество ооцита определяется не только ядерной ДНК, но и цитоплазматической средой, которая содержит митохондрии, мРНК, белки и регуляторные факторы, контролирующие раннее эмбриональное развитие до активации эмбрионального генома. В стареющих ооцитах и в яйцеклетках женщин с многократными неудачами ЭКО этот цитоплазматический механизм часто нарушается, даже если хромосомы кажутся нормальными (May-Panloup et al., 2016; Fragouli and Wells, 2015).

В этом контексте митохондрии играют особенно важную роль. Ооциты содержат сотни тысяч митохондрий, гораздо больше, чем любой другой тип клеток, поскольку оплодотворение и раннее эмбриональное дробление требуют чрезвычайно высокого уровня выработки энергии. С возрастом у женщин в митохондриальной ДНК накапливаются мутации, снижается выработка АТФ и увеличивается количество активных форм кислорода, что приводит к нарушению формирования веретена деления, ошибкам сегрегации хромосом и плохому развитию эмбриона (Бентов и Каспер, 2013; Мэй-Панлуп и др., 2016). Цитоплазматический перенос направлен на частичное восстановление этой метаболической среды путем введения здоровых митохондрий и связанных с ними цитоплазматических факторов из молодого донорского ооцита в яйцеклетку пациентки во время ИКСИ.

В отличие от митохондриальной заместительной терапии (МЗТ), цитоплазматическая трансплантация не удаляет все цитоплазматические структуры пациента, включая митохондрии, и не заменяет их полностью. Вместо этого часть цитоплазмы собственной яйцеклетки пациента аспирируется (опорожняется), и соответствующий объем донорской цитоплазмы, обычно 10–151 ТП3Т от всей цитоплазмы, вводится вместе со сперматозоидом. Это означает, что полученный эмбрион содержит смесь митохондрий, в основном от пациента и небольшой доли от донора. Цель состоит не в создании «эмбриона от трех родителей» в генетическом смысле, а в улучшении клеточной биоэнергетики, чтобы ядерная ДНК пациента могла должным образом экспрессироваться на ранних стадиях развития (Barritt et al., 2001; Zhang et al., 2017).

Почему используется лишь такая малая доля цитоплазмы, полученная от донора яйцеклетки?

Перенос цитоплазмы намеренно ограничивается небольшой долей цитоплазмы донора, поскольку цель состоит в том, чтобы поддержать ооцит пациентки, а не заменить его.

Яйцеклетка — это не просто контейнер для ДНК. Ее цитоплазма содержит высокоорганизованную, пространственно структурированную сеть митохондрий, мРНК, рибосом, запасов кальция, белков, закрепляющих веретено деления, и сигналов полярности, которые формировались в течение многих месяцев созревания ооцита. Эти структуры определяют место формирования веретена деления, ориентацию первых митотических делений и установление эмбриональных осей. Если заменить слишком много цитоплазмы, существует риск нарушения этой организации. Замена большого объема цитоплазмы может нарушить колебания кальция при оплодотворении, позиционирование веретена деления и геометрию раннего деления, которые чрезвычайно чувствительны к архитектуре цитоплазмы (May-Panloup et al., 2016; Schatten & Sun, 2011). Именно здесь перенос цитоплазмы может быть фактически более выгодным по сравнению с полной заменой при МРТ, если только возраст пациентки не превышает 40 лет, а собственные цитоплазматические структуры не считаются неоптимальными.

На митохондриальном уровне для достижения метаболической коррекции без генетического захвата выбирается окно 10–15%. Человеческая яйцеклетка содержит примерно 100 000–300 000 митохондрий. В стареющих или поврежденных яйцеклетках митохондрии могут производить меньше АТФ и больше активных форм кислорода, что нарушает целостность веретена деления и развитие эмбриона. Введение здоровой донорской цитоплазмы с 10–15% обеспечивает поступление десятков тысяч функциональных митохондрий, чего достаточно для значительного увеличения выработки АТФ и снижения окислительного стресса в цитоплазме (Bentov & Casper, 2013; Fragouli & Wells, 2015).

Однако, если ввести слишком много донорской цитоплазмы, возникнет высокая степень митохондриальной гетероплазмии. Это означает, что две конкурирующие популяции митохондрий будут присутствовать на сопоставимых уровнях. В экспериментах на животных и в исследованиях клеток человека высокая гетероплазмия может приводить к сегрегации митохондрий на ранних стадиях клеточного деления, непредсказуемому распределению в тканях и, в некоторых случаях, к потере метаболической эффективности с течением времени из-за конкуренции несовместимых популяций митохондрий (Wallace & Chalkia, 2013; Stewart & Chinnery, 2015). Поддерживая донорские митохондрии в диапазоне 10–15%, большинство эмбрионов естественным образом возвращаются к доминированию митохондрий пациента в последующих делениях, при этом продолжая получать пользу от раннего метаболического стимула на критических стадиях дробления и бластоцисты.

Именно поэтому цитоплазматический перенос принципиально отличается от митохондриальной заместительной терапии. При митохондриальной заместительной терапии намеренно удаляются почти все митохондрии пациента и заменяются донорскими митохондриями в новой цитоплазматической среде, чтобы предотвратить митохондриальные заболевания. Цитоплазматический перенос делает обратное: он сохраняет цитоплазматическую идентичность пациента и ядерно-цитоплазматическую совместимость, одновременно обеспечивая яйцеклетку достаточным количеством здоровых механизмов для прохождения ранних стадий развития. Оба метода имеют свои преимущества для разных групп пациентов.

Что может и чего не может сделать цитоплазматический перенос

Цитоплазматический перенос может улучшить показатели оплодотворения, динамику дробления и формирование бластоцист у отдельных пациенток, у которых не удается зачать ребенка, несмотря на нормальную сперму и удовлетворительный ответ яичников. В ранних клинических исследованиях цитоплазматический перенос был связан с более высокими показателями развития эмбрионов и рождением живых детей у женщин с повторными неудачами ЭКО (Barritt et al., 2001). Более поздние работы показали, что улучшение функции митохондрий в стареющих или поврежденных ооцитах может напрямую улучшить стабильность веретена деления, выработку АТФ и компетентность эмбриона (Bentov and Casper, 2013; Fragouli and Wells, 2015). Это делает цитоплазматический перенос особенно актуальным для женщин с возрастной дисфункцией ооцитов, плохим развитием эмбрионов, несмотря на хромосомно нормальные эмбрионы, или повторными неудачами имплантации.

Однако не менее важно четко понимать, чего не может сделать цитоплазматический перенос. Он не исправляет хромосомные аномалии в яйцеклетке. Если в ооците наблюдается нерасхождение хромосом или серьезное повреждение ДНК, добавление здоровой цитоплазмы это не исправит. Он также не устраняет наследственные митохондриальные заболевания, поскольку митохондрии пациента остаются доминантными в эмбрионе. По этой причине цитоплазматический перенос не используется для предотвращения передачи митохондриальных генетических заболеваний; для этого существует метод МРТ, при котором ядерная ДНК переносится в донорскую яйцеклетку, содержащую только здоровые митохондрии (Craven et al., 2010; Hyslop et al., 2016).

На практике цитоплазматический перенос лучше всего рассматривать как стратегию метаболической коррекции для яйцеклеток с интактной ядерной ДНК, но нарушенным клеточным механизмом. Он может улучшить развитие эмбриона и имплантационный потенциал у определенной группы пациенток, но не отменяет генетические изменения, не омолаживает хромосомы и не заменяет донорские яйцеклетки в случаях тяжелой анеуплоидии или недостаточности яичников. При правильном применении он занимает промежуточное положение между стандартным ЭКО и полной митохондриальной заместительной терапией, предлагая биологически рациональный способ повышения компетентности ооцитов без замены генетической идентичности пациентки.

Как работает цитоплазматическая ЭКО в клинической практике?

В современных программах цитоплазматического переноса процедура не строится вокруг одной яйцеклетки. Она основана на вероятности, избыточности и отборе, поскольку даже при улучшении цитоплазматической функции ядерная генетика ооцита все еще подчиняется возрастным биологическим особенностям. По этой причине мы стремимся работать как минимум с пятью зрелыми (M2) ооцитами в качестве практического порога для получения значимых результатов. Это не произвольное решение. Показатели оплодотворения, образования бластоцист и эуплоидии действуют как мультипликативные вероятности. Когда доступны только один или два ооцита, даже биологически успешный цитоплазматический перенос имеет высокую вероятность не получить эмбрион, пригодный для переноса, просто из-за статистического отсева (Fragouli & Wells, 2015; Franasiak et al., 2014).

Поскольку многие пациентки, являющиеся кандидатами на цитоплазматический перенос, плохо реагируют на стимуляцию или находятся в позднем репродуктивном возрасте, получение пяти ооцитов M2 за один цикл может быть невозможно. В таких случаях накопление ооцитов в ходе нескольких процедур забора спермы становится важной частью стратегии. Каждая процедура забора спермы увеличивает пул ооцитов M2, которые могут быть оплодотворены и подвергнуты цитоплазматической подпитке. Эта концепция хорошо зарекомендовала себя в ЭКО с низким резервом и в сохранении фертильности, где кумулятивное количество ооцитов, а не количество ооцитов за один цикл, является наиболее сильным предиктором успеха (Cobo et al., 2016; Vaiarelli et al., 2020). В контексте цитоплазматического переноса накопление еще более важно, поскольку эта методика применяется к яйцеклеткам, которые уже имеют неблагоприятные биологические условия.

Порог в пять ооцитов имеет значение не только для оплодотворения, но и для развития эмбриона и генетической селекции. Даже в оптимизированных циклах ЭКО лишь часть оплодотворенных яйцеклеток достигает стадии бластоцисты, и лишь часть бластоцист имеет нормальный хромосомный набор. Большие массивы данных ПГТ-А показывают, что у женщин в возрасте 40 лет только 10–301 ТП3Т бластоцист являются эуплоидными, даже при хорошем развитии эмбриона (Franasiak et al., 2014; Tiegs et al., 2020). Цитоплазматический перенос может улучшить способность к развитию, то есть больше эмбрионов достигают стадии бластоцисты, но он не меняет частоту мейотических ошибок, вызывающих анеуплоидию. Это означает, что для получения здорового эмбриона по-прежнему необходимо определенное количество ооцитов.

Именно поэтому цитоплазматический перенос наиболее эффективен, когда он включен в стратегию, направленную на получение нескольких эмбрионов, за которой следует Тестирование PGT-A Чтобы определить, какие из этих эмбрионов действительно имеют нормальные хромосомы, необходимо провести цитоплазматическую стимуляцию. Цитоплазматическая добавка помогает эмбрионам пережить метаболический стресс на ранних стадиях развития и достичь стадии бластоцисты, но именно преимплантационная генетическая диагностика атипичной овуляции (ПГД-А) позволяет отобрать эмбрион, обладающий как улучшенной цитоплазматической функцией, так и интактной ядерной генетикой. Без этого заключительного этапа отбора польза от цитоплазматического переноса нивелируется высокой фоновой частотой анеуплоидии, особенно у пациентов старшего возраста (Fragouli & Wells, 2015; Tiegs et al., 2020).

С точки зрения вероятности, это означает, что чем больше эмбрионов можно создать, тем выше вероятность успеха. Каждый ооцит M2 имеет определенный шанс оплодотворения, каждая оплодотворенная яйцеклетка имеет определенный шанс стать бластоцистой, и каждая бластоциста имеет определенный шанс быть эуплоидной. Цитоплазматический перенос увеличивает промежуточный этап, формирование бластоцисты, но не устраняет конечное узкое место, которым является хромосомная нормальность. Таким образом, накопление ооцитов до достижения как минимум пяти M2, создание нескольких эмбрионов, а затем использование ПГТ-А для выбора лучшего из них – это способ превращения цитоплазматического переноса из биологически интересной методики в клинически значимый метод лечения (Franasiak et al., 2014; Vaiarelli et al., 2020).

На практике это означает, что некоторым пациенткам потребуется две, три или даже больше процедур забора яйцеклеток до проведения преимплантационной генетической диагностики и переноса эмбрионов, чтобы обеспечить достаточное количество эмбрионов для оправдания процедуры. Цель состоит не в том, чтобы быстро получить один эмбрион, а в том, чтобы сформировать когорту эмбрионов, из которых можно будет выбрать генетически здоровый, способный к развитию эмбрион, что даст пациентке реальный шанс на беременность, а не одну попытку с низкими шансами.